基于Cas12a的诊断试纸被比作口袋里的PCR
在SARS-CoV-2大流行开始时，感到不适的人们必须排起长队进行实验室PCR检测，然后等待两天才能了解自己是否感染了病毒。悉尼新南威尔士大学(UNSW)的生物医学工程师现已开发出一种快速测试条技术，该技术利用自催化Cas12a环状DNA扩增反应(AutoCAR)系统，他们声称该系统与基于实验室的PCR测试一样准确，但提供了快速检测、现场疾病检测。
该团队建议，该技术的应用就像“口袋里的PCR”一样，可能会超出公共卫生范围，并为食品工业、农业和生物安全管理领域的生物医学和环境诊断开辟可能性。
“我们不仅可以轻松检测样本中的特定基因序列，而且与PCR不同，我们可以在室温下使用看起来与众所周知的RAT测试一模一样的测试条进行检测-您已经知道如何使用它，新南威尔士大学生物医学工程研究生院的研究负责人EwaGoldys博士说道。“所以，以后PCR检测就不用再排队了。而且，成本非常低——目前每次测试不到几美元。”
联合研究员邓飞博士表示，新的测试条可以加快对蚊媒或块状皮肤病等新兴病原体的快速反应，揭示抗生素耐药性的热点或帮助寻找受威胁的动物物种。“我们认为我们在生物传感方面创造了一个新的基准——我们的基于基因的测试将能够随时随地由几乎任何人进行......这可能会改变人类和动物感染控制以及检疫和生物多样性保护工作，”邓说。
邓是该团队在《自然通讯》上新发表的论文的第一作者，该论文题为“CircularDNAnanostructstoCas12a激活的拓扑屏障促进自动催化并改变DNA/RNA传感”。该团队在报告中得出结论：“……与CRISPR生物传感器使用的其他信号放大方法(例如SERS、金属增强荧光、纳米酶和场效应晶体管)不同，AutoCAR不需要任何复杂的组件或仪器，并且可以在室温、护理点环境下进行。”
共同作者李毅博士解释说，为了生成符合PCR标准的测试条，该团队首先制作了微小的DNA纳米环，其中包含目标DNA的短序列，例如新冠病毒。每个纳米圆的大小只有约两纳米。然后，DNA纳米环和测试样本与CRISPR/Cas蛋白混合，新南威尔士大学团队对CRISPR/Cas蛋白进行编程，以切割纳米环的DNA，但前提是被目标病原体的DNA激活。
“适当编程的CRISPR/Cas蛋白与我们试图检测的基因靶标的相互作用会导致DNA纳米环破裂、线性化并成为‘假靶标’，”Li评论道。作者进一步解释说，“……部分匹配引导RNA序列的小型圆形DNA纳米结构只能最低程度地激活Cas12a核糖核蛋白。然而，线性化这些结构可以恢复激活。”
然后这种方法会产生分子链式反应。“我们释放了大量的假目标，即使只存在原始基因目标的几个分子，也很容易用测试条检测到，”李补充道。正如作者进一步指出的那样，“与PCR、RPA和LAMP48等传统核酸扩增技术相比，AutoCAR提供了相当的灵敏度(1aM)，但没有温度循环或加热，也没有聚合等引物问题。”
使用COVID-19病毒和引起胃溃疡的螺杆菌样本对该方法进行了评估。该团队在论文中指出，“……我们测试了AutoCAR-3直接检测人血浆中PI3KCAH1047R突变的能力。血液样本选自已知携带PI3KCA突变的肿瘤患者以及没有该突变的对照癌症患者……结果显示癌症和对照样本之间具有统计学上的显着差异……这也可以作为DNA单核苷酸多态性可行性的证据检测”。
研究小组进一步证实，该系统可以检测其他类型临床样本(例如唾液)中的目标DNA。“结果还表明，检测到的目标PIK3CAH1047R突变序列的存在具有100%的准确度。”
Goldys表示，业界对团队创新的反应非常积极。“我们的技术向澳大利亚工业的工业和临床推广已经开始，目的是将制造留在国内，”戈尔迪斯评论道。“我们将利用新兴的工业基础设施来生产RNA疫苗。”
戈尔迪斯进一步指出，新的生物传感方法可能在生物安全方面的一些应用，其中测试条可以检测潜在的入侵海洋物种。另一个应用可能是环境科学，其中环境样本的DNA测试可以表明特定受威胁物种的存在或不存在。生物传感带的一种有趣的潜在用途可能是检测癌细胞。“在我们发表的研究中，我们还能够在临床环境中检测患者样本中的癌症突变，”戈尔迪斯指出。“我们希望这将为接受癌症治疗的患者进行普遍监测开辟一条道路。”
研究人员总结他们的结果时得出结论：“凭借其简单性和简约的设计，本文报道的自催化AutoCAR系统有望为快速、低成本和超灵敏的核酸定量提供途径，包括在护理点和现场。这将拓展CRISPR/Cas生物技术的边界并拓宽其应用。”