基于病毒RNA的诊断纳米孔系统可能优于PCR

研究人员希望该技术将代表快速诊断未来的重大创新。“这可能会成为下一个大型诊断系统，”杨百翰大学电气和计算机工程教授亚伦·霍金斯博士说。“你生病了，你去医院或医生，他们的测试依赖于这项技术。有一条路径可以将其安装在[医院或诊所]，因此您无需等待即可获得结果。”

这项新技术是霍金斯、加州大学圣克鲁斯分校电气和计算机工程杰出教授HolgerSchmidt博士和德克萨斯生物医学研究所JeanPatterson博士之间长期合作的成果。该团队在PNAS上发表的报告标题为“使用捕获辅助光流控纳米孔平台对灵长类生物流体进行无标记和无扩增病毒RNA定量”。在他们的论文中，该团队得出结论：“无扩增纳米孔测定的多功能性、性能、简单性和完全微流体集成的潜力指向了一种独特的核酸、蛋白质和其他目标分子诊断方法……这些设备可以寻找POC诊断、协助动物模型开发的研究工具以及许多其他领域的应用。”

作者写道，近几十年来，发生了多种病毒大流行，包括猪流感、埃博拉、寨卡和COVID-19，因此需要快速、准确的诊断。“由于疫苗接种和抗病毒药物等预防措施往往有限或无法获得，因此有必要开发简单、低成本、低复杂性、高灵敏度、高速度和准确度的即时护理(POC)诊断技术”。

然而，虽然酶联免疫吸附测定(ELISA)等现有且廉价的抗原测试适合POC使用，但该团队继续说道，“……当生物标志物浓度较低时，它们的灵敏度和可靠性较差。”因此，PCR检测仍然是病毒学检测准确性的黄金标准。但该方法在几个方面存在缺陷。研究人员表示：“PCR很复杂，需要昂贵的试剂、中心实验室基础设施和训练有素的人员，因此不适合在资源匮乏的环境中使用。”有时也可能需要几天时间才能得到测试结果。

这些复杂的PCR反应是病毒DNA或RNA扩增所必需的，这是一个制造遗传物质多个副本的过程，可能会引入和放大错误。PCR检测也只能检测核酸，而对于某些疾病，检测蛋白质等其他生物标志物可能会很有用。

施密特、霍金斯和帕特森及其团队现已开发出一种诊断工具，可以解决与PCR相关的缺陷。这项新技术几乎不需要样品制备，并且无需扩增和标记，因此不使用光来识别生物标志物。研究小组认为，这些功能极大地减少了诊断过程的时间和复杂性。“潜力是巨大的，”帕特森说。“无需进行扩增即可获得准确结果的想法是一个巨大的进步，就像PCR出现时令人难以置信的进步一样。”

新的诊断系统结合了施密特在光流控领域的专业知识，即用光束控制微量流体，以及用于计算单个核酸以读取遗传物质的纳米孔。该工具旨在测试寨卡病毒和SARS-CoV-2，这一直是资助这项研究的美国国立卫生研究院的优先领域。

“我们建立了一个简单的芯片实验室系统，可以在微流体、硅芯片和纳米孔检测技术的帮助下进行微型水平的测试，”施密特的研究生、该论文的第一作者MohammadJulkerNeyenSampad说道。作者。“简单、容易、低资源的工具开发是我们的目标，我相信我们已经实现了。”

为了进行测试，将生物流体样本与磁性微珠混合在容器中。在这项研究中，研究人员使用了德克萨斯生物医学研究所的生物体液，包括来自狒狒(SARS-CoV-2)和狨猴(针对寨卡病毒)的唾液和血液。

微珠的设计与测试所要检测的疾病的RNA序列相匹配。因此，对于COVID-19检测测试，微珠上将带有SARS-CoV-2RNA链。如果样本中存在SARS-CoV-2病毒，该病毒的RNA将与珠子结合。经过短暂的等待后，研究人员将磁珠拉到容器底部，并洗掉其他所有东西。

这些珠子被放入由霍金斯小组设计和制造的硅微流体芯片中，它们流过一个由超薄膜覆盖的细长通道，霍金斯称这种设计为“工程奇迹”。珠子被光束捕获，将它们推向通道壁，通道内有一个直径仅为20nm的纳米孔。作为比较，人类头发的宽度约为80,000–100,000纳米。研究人员对芯片加热，使RNA颗粒从珠子上脱落并被吸入纳米孔中，从而检测到病毒RNA的存在。

该团队的试验表明，即使在病毒浓度极低的情况下，该测试也能正确检测出PCR测试也能够检测到的每个样本的病毒。在某些情况下，新测试可以检测到病毒，而PCR测试却不能，这表明研究人员的系统甚至可以比PCR更准确。“......我们发现纳米孔传感器与所有PCR阳性样本产生定性和定量一致性，并且能够为未产生PCR结果的多个样本提供病毒载量读数，这可能是由于该方法的复杂性，”作者评论道。

该测试使用了六种不同的生物流体，包括唾液、血液和咽拭子，它们可能含有不同的病毒载量。这可以使研究人员更好地研究疾病如何通过不同动物的身体传播。“将这种光流控纳米孔平台纳入一项纵向病毒载量监测研究中，该研究包括两种致命病毒感染(即寨卡病毒和SARS-CoV-2)和六种不同类型的生物流体，显示了该测定的多功能性，为固体病毒铺平了独特的道路。-从临床样本中进行基于纳米孔的分子诊断，无需核酸测序和扩增，”研究人员声称。

此外，新的微流体系统比PCR机更小，也更简单。如果这一概念作为产品推向市场，其紧凑的尺寸可以轻松放入研究人员的实验室，从而更快地获得病毒学测试结果，提高测试的可及性，并将获得结果的时间从几天缩短到几小时。“如果我们用这个系统构建一个仪器，研究人员就可以在生物安全4级实验室中使用它，它永远不会离开房间，你只需滴入一点样品液体，然后在一小时内运行测试，”施密特说道。“我认为这将有助于加快测试速度。”

在他们报告的研究中，研究人员开发了检测SARS-CoV-2和寨卡病毒的测试，但它也可以被设计为检测任何有基因样本的病毒。在未来的发展中，该团队计划进一步简化系统，并开发能够实现多重检测的技术，以便它可以同时测试多种类型的疾病。“未来，检测的样品制备步骤可以进一步简化和小型化，”该团队写道。“此外，该方法可以扩展到使用各种策略的多重分析。”

Schmidt打算使用相同的策略来开发癌症生物标志物和其他在体内留下DNA/RNA或蛋白质痕迹的健康状况的诊断工具。“总而言之，这项工作为一类通用集成纳米孔传感器指明了道路，该传感器将高性能与低至中等复杂性相结合……这些结果表明，光流控纳米孔传感可以形成临床生物标志物诊断的独特范例的基础，以及动物模型开发和其他应用的研究工具，”该团队总结道。