研究生物体内肝细胞的新技术可以揭示再生所需的基因

肝脏的自我再生能力堪称传奇。即使超过70%的器官被移除，剩余的组织也可以重新长出一个完整的新肝脏。

麻省理工学院生物学助理教授克里斯汀·诺斯(KristinKnouse)想要了解肝脏如何实现这种再生，希望了解如何诱导其他器官做同样的事情。为此，她的实验室开发了一种使用基因编辑系统CRISPR对小鼠肝脏进行全基因组研究的新方法。

利用这项新技术，研究人员可以研究小鼠基因组中的每个基因如何影响特定的疾病或行为。在一篇描述该技术的论文中，研究人员发现了几个对肝细胞存活和增殖很重要的基因，这些基因以前在实验室培养皿中生长的细胞研究中没有发现。

“如果我们真的想了解哺乳动物的生理学和疾病，我们应该尽可能在活的有机体中研究这些过程，因为这是我们可以在最原始的环境中研究生物学的地方，”Knouse说，他也是麻省理工学院科赫研究所的成员综合癌症研究所。

Knouse是这篇新论文的高级作者，该论文今天发表在CellGenomics上。怀特黑德研究所功能基因组学平台主任HeatherKeys是该研究的合著者。

细胞外环境

作为麻省理工学院的研究生，Knouse使用再生肝组织作为模型来研究细胞分裂的一个方面，称为染色体分离。在这项研究中，她观察到在肝脏中分裂的细胞与在实验室培养皿中分裂的肝细胞表现不同。

她说：“我从这项研究中了解到，细胞分裂等细胞固有的东西，我们长期以来认为独立于细胞外任何事物的东西，在多大程度上明显受到细胞外环境的影响。”“当我们研究培养细胞时，我们失去了细胞外环境的影响。”

然而，许多类型的研究，包括使用CRISPR等技术的全基因组筛选，更难以在整个生物体的规模上部署。CRISPR基因编辑系统由一种称为Cas9的酶组成，它在给定位置切割DNA，由一条称为向导RNA的RNA指导。这使得研究人员能够在大量细胞中敲除每个细胞的一个基因。

虽然这种方法可以揭示参与特定细胞过程的基因和蛋白质，但事实证明很难将CRISPR成分有效地递送到体内足够多的细胞以使其可用于动物研究。在一些研究中，研究人员使用CRISPR敲除大约100个感兴趣的基因，如果他们知道他们想要研究哪些基因，这将很有用，但这种有限的方法不会揭示与特定功能或疾病相关的新基因。

一些研究小组已经使用CRISPR在大脑和皮肤细胞中进行全基因组筛选，但这些研究需要大量小鼠才能发现重要的命中。

“对我们来说，我认为还有许多其他研究人员，小鼠模型有限的实验易处理性长期以来阻碍了我们以公正和全面的方式深入研究哺乳动物生理学和疾病问题的能力，”Knouse说。“这就是我真正想要改变的，将曾经仅限于细胞培养的实验易处理性带入生物体，这样我们就不再局限于在其本土背景下探索生理学和疾病基本原理的能力。”

为了让引导RNA链进入肝细胞(肝脏中的主要细胞类型)，Knouse决定使用慢病毒，这是一种工程化的非致病性病毒，通常用于将遗传物质插入细胞基因组。她将引导RNA注射到新生小鼠体内，一旦引导RNA整合到基因组中，它就会随着小鼠的成长传递给后代的肝细胞。经过几个月在实验室的努力，她能够获得在数千万个肝细胞中一致表达的指导RNA，这足以在一只动物身上进行全基因组筛选。

细胞健康

为了测试该系统，研究人员决定寻找影响肝细胞健康的基因——肝细胞生存和增殖的能力。为此，他们提供了一个包含70,000多个引导RNA的文库，靶向13,000多个基因，然后确定每次敲除对细胞适应性的影响。

用于该研究的小鼠经过精心设计，因此可以在其一生中的任何时候打开Cas9。使用一组四只老鼠——两只雄性和两只雌性——研究人员在老鼠五天大时开启了Cas9的表达。三周后，研究人员筛选了他们的肝细胞并测量了每种引导RNA的含量。如果特定的指导RNA丰富，这意味着它所针对的基因可以被敲除而不会对细胞造成致命伤害。如果引导RNA没有出现在屏幕上，则意味着敲除该基因对细胞来说是致命的。

该筛选产生了数百个与肝细胞适应性相关的基因，并且四只小鼠的结果非常一致。研究人员还将他们鉴定的基因与与人类肝病相关的基因进行了比较。他们发现新生儿肝功能衰竭综合征中发生突变的基因也在他们的筛选中导致肝细胞死亡。

该屏幕还揭示了在实验室培养皿中生长的肝细胞研究中未发现的关键健康基因。其中许多基因与免疫细胞或细胞周围细胞外基质中的分子相互作用。Knouse说，这些途径可能没有出现在培养细胞的筛选中，因为它们涉及细胞与其外部环境的相互作用。

通过比较雄性和雌性小鼠的结果，研究人员还发现了几个对健康有性别特异性影响的基因，这些基因不可能通过单独研究细胞来获得。

更新和再生

Knouse现在计划使用该系统来识别对肝脏再生至关重要的基因。

“很多组织比如心脏是无法再生的，因为它们缺乏干细胞，分化的细胞无法分裂。但是，肝脏也是一种高度分化的组织，缺乏干细胞，但它仍然保持着这种惊人的再生能力。受伤，”她说。“重要的是，肝细胞的基因组与心脏细胞的基因组没有什么不同。所有这些细胞的细胞核中都有相同的指导手册，但肝细胞显然正在阅读该手册中的不同句子以进行再生。我们不知道的是，那些句子是什么?那些基因是什么?如果我们能识别出这些基因，也许有一天我们就能指导心脏再生。”

这种新的筛查技术还可用于研究脂肪肝和肝硬化等疾病。Knouse的实验室也在致力于将这种方法扩展到肝脏以外的器官。

“我们需要找到让引导RNA高效进入其他组织的方法，”她说。“在克服这一技术障碍后，我们就可以建立与我们现在在心脏或其他问题中的肝脏相同的实验易处理性。”